Le cannabidiol déclenche le déclenchement du canal TRPV2 sensibilise les cellules du glioblastome aux agents chimiothérapeutiques cytotoxiques | Cancérogenèse

 – La meilleur Huile de CBD

Le cannabidiol déclenche le déclenchement du canal TRPV2 sensibilise les cellules du glioblastome aux agents chimiothérapeutiques cytotoxiques | Cancérogenèse – La meilleur Huile de CBD

Abstrait

Le comportement agressif du glioblastome multiforme (GBM) est principalement dû à son pouvoir invasif et à son taux de prolifération élevés, ainsi qu’à sa grande résistance à la chimiothérapie standard. Plusieurs agents chimiothérapeutiques tels que le témozolomide (TMZ), la carmustine (BCNU) ou la doxorubicine (DOXO) ont été utilisés pour le traitement du GBM, mais leur efficacité est limitée. Par conséquent, il est important d'identifier de nouvelles modalités de traitement pour améliorer les effets thérapeutiques et améliorer la chimiosensibilité des GBM. Récemment, il a été démontré que l’activation du potentiel de récepteur transitoire vanilloïde type 2 (TRPV2) inhibe la prolifération des cellules GBM humaines et surmonte la résistance à la BCNU des cellules GBM. Ici, nous avons évalué l'implication de l'activation de TRPV2 induite par le cannabidiol (CBD), dans la modulation de la chimiosensibilité des cellules de gliome à TMZ, BCNU et DOXO. Nous avons constaté que le CBD augmente l'expression et l'activité de TRPV2. CBD en déclenchant du Ca dépendant de TRPV2 2+ l'influx augmente l'absorption de médicament et synergise avec les agents cytotoxiques pour induire l'apoptose des cellules de gliome, alors qu'aucun effet n'a été observé dans les astrocytes humains normaux. De plus, comme la région des pores des canaux du potentiel transitoire du récepteur (TRP) est essentielle à la perméation des canaux ioniques, nous avons démontré que la suppression du poredomaïne de TRPV2 inhibe le Ca induit par le CBD. 2+ afflux de médicaments, absorption de médicaments et effets cytotoxiques. Globalement, nous avons démontré que la co-administration d'agents cytotoxiques avec le CBD agoniste de TRPV2 augmentait l'absorption du médicament et potentialisait parallèlement l'activité cytotoxique dans les cellules de gliome humain.

introduction

Le glioblastome multiforme (GBM) est la classe la plus fréquente de tumeurs primitives du cerveau malignes. Il s’agit de l’un des cancers les plus dévastateurs avec une survie médiane d’environ 12 à 15 mois (1). Le comportement agressif du GBM est principalement dû à son pouvoir invasif et à son taux de prolifération élevés, ainsi qu’à sa grande résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie classiques (2). Plusieurs agents chimiothérapeutiques tels que le témozolomide (TMZ), la carmustine (BCNU) et la doxorubicine (DOXO) sont utilisés dans la gestion clinique de la GMB, mais leur efficacité est limitée. Par conséquent, il est important d'identifier de nouvelles modalités de traitement, ainsi que de modifier les thérapies existantes afin d'améliorer leurs effets thérapeutiques sans augmenter leur toxicité (3). Une approche prometteuse pour atteindre ces objectifs consiste à améliorer la chimiosensibilité des gliomes aux schémas thérapeutiques existants.

Des données récentes ont décrit le rôle fonctionnel de certains canaux cationiques à potentiel de récepteur transitoire (TRP) dans la régulation de la croissance et de la progression des cellules GBM (4, 5). À cet égard, nous avons précédemment signalé que le déclenchement de TRP vanilloïde-1 (TRPV1) par la capsaïcine (CPS), un agoniste synthétique, induit l'apoptose des cellules de gliome dépendante de la protéine kinase activée par le mitogene p38 (6). De plus, nous avons récemment démontré que TRP vanilloid-2 (TRPV2), un paralogue de TRPV1, inhibe la prolifération des cellules GBM et surmonte la résistance des cellules GBM au traitement par BCNU (7).

Les canaux TRP sont des protéines transmembranaires à formation de pores permettant aux ions et aux xénobiotiques de pénétrer dans les membranes biologiques (8). Le domaine des pores joue un rôle crucial dans la détermination des propriétés de pénétration et de sélectivité du canal TRP. Des expériences récentes démontrent clairement que le motif de séquence GM (L) GD dans la région de pore putative de TRPV1 / 2/3/4 détermine le 2+ et Mg 2+ propriétés de perméation de ces canaux (8, 9). Une introduction sélective de molécules chargées dans des cellules cibles spécifiques par permeation à travers des canaux de TRPV a été démontrée (10-14). Le traitement avec l'agoniste de synthèse TRPV1 CPS en ouvrant les canaux TRPV1 permet l'introduction sélective dans les neurones sensibles à la douleur exprimant TRPV1 d'un dérivé de lidocaïne membranaire chargée (QX-314) avec une masse moléculaire de 263Da et d'un colorant FMI-43 , avec une masse moléculaire de 452Da (11). De plus, il a été rapporté que l'entrée de capsaïcinoïdes analogues à la CPS dans les neurones détecteurs nécessite le domaine des pores du TRPV1 et que ce processus est renforcé par l'activation de la protéine kinase C (PKC) et de la protéine kinase A (PKA) ou par une modification covalente oxydante (15).

L'introduction sélective de molécules antiprolifératives et cytotoxiques par pénétration dans différents types de cellules cancéreuses exprimant des canaux TRP a récemment été suggérée (14). Parmi ces canaux, nous avons évalué le rôle potentiel de TRPV2 dans la perméation des médicaments cytotoxiques dans les cellules GBM.

TRPV2 est un canal cationique non sélectif montrant Ca 2+ perméabilité. Structurellement, il est composé de six domaines transmembranaires, d'une région de boucle de pore putative, d'un amino terminal cytoplasmique avec trois domaines de répétition d'ankyrine et d'un carboxy terminal cytoplasmique (16).

Des études fonctionnelles ont révélé que TRPV2 répond à la chaleur nocive avec un seuil d'activation supérieur à 52 ° C, ainsi qu'aux modifications de l'osmolarité et de l'étirement de la membrane (16). Le canal TRPV2 est déclenché par des agonistes tels que Δ 9 -tétrahydrocannabinol (Δ 9 -THC) et le cannabidiol (CBD) (17,18). De nombreuses études ont suggéré que l'activation de TRPV2 par des facteurs de croissance provoque une translocation de canal indépendante et dépendante de PI-3K vers la membrane plasmique (19, 20). Les cannabinoïdes font l’objet d’une attention croissante pour le traitement de la GBM car ils peuvent favoriser la mort des cellules de gliome, à la fois in vitro et in vivo (21, 22). Parmi les composés cannabinoïdes, le CBD, un cannabinoïde dépourvu de toute responsabilité psychotrope indésirable du THC (22, 23), a été étudié en tant qu'agent antitumoral. De plus, il a été constaté que le CBD avait des effets anti-inflammatoires, antioxydants et neuroprotecteurs (24). In vivo , CBD améliore les effets inhibiteurs de Δ 9 -THC sur la survie et la prolifération de cellules GBM humaines (25), et sa combinaison avec TMZ plus Δ 9 -THC réduit la croissance des xénogreffes de gliomes (26). In vitro , Le CBD inhibe la migration (27) et induit l'apoptose dans les cellules de gliome humain (28, 29). Le but de cette étude était d'évaluer l'implication de l'activation du canal TRPV2 dans la sensibilisation des cellules GBM à des agents chimiothérapeutiques, tels que BCNU, TMZ ou DOXO. En outre, nous avons analysé l’influence de la région des pores de TRPV2 sur l’absorption du médicament et la chimiosensibilité dans les cellules de gliome humain.

matériaux et méthodes

Lignées cellulaires

La lignée cellulaire de gliome U87MG (American Type Culture Collection; LGC Promochem, Teddington, Royaume-Uni) a été cultivée telle que publiée précédemment (7). Des cellules de glioblastome primaire MZC ont été préparées à partir de la digestion enzymatique de l'échantillon bioptique prélevé chirurgicalement chez un patient atteint de GBM de grade IV, qui avait donné son consentement éclairé à l'étude, et isolé comme décrit précédemment (7). Des astrocytes humains normaux (NHA) (Cambrex, Berkshire, Royaume-Uni) ont été cultivés dans un système de milieu de croissance astrocyte (Cambrex) et utilisés dans un délai de 10 passages pour éviter la réactivité biologique et la détérioration de la fonction.

Réactifs

Le chlorhydrate de 1,3-bis (2-chloroéthyl) -l-nitrosurée (BCNU), TMZ et DOXO ont été achetés chez Sigma – Aldrich (St. Louis, MO). Le CBD, le rouge de ruthénium (RR) et l'acide éthylène-glycol-bis (2-aminoéthyléther) -N, N, N ', N'-tétraacétique (EGTA) ont été achetés auprès de Tocris-Bioscience (Bristol, Royaume-Uni).

Analyse de l'expression génique

L’ARN total a été isolé à l’aide du kit RNeasy Mini (Qiagen GmbH, Milan, IT) et l’ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé à l’aide du kit d’archives cADN haute capacité (Life Technology, Milan, IT) conformément aux instructions du fabricant. PCR en temps réel duplex pour TRPV2 a été réalisée en utilisant le système de détection PCR en temps réel multicolore iQ5 (Bio-Rad, Hèrcules, CA), tel que publié précédemment (7). Tous les échantillons ont été dosés en triple dans la même plaque. La mesure des taux de β-actine a été utilisée pour normaliser le contenu en ARN messager (ARNm), et TRPV2 les niveaux ont été calculés par le 2 −ΔΔCt méthode et exprimée en repli relatif par rapport au témoin correspondant.

Constructions plasmidiques

Le plasmide codant pour l'homme TRPV2 (pCMV-TRPV2) a été construit en introduisant dans le cadre l'ADNc de TRPV2 dans des sites de clonage BglII / HindIII pCMV-FSR (Genlantis, San Diego, Californie) (7). Suppression de la séquence d'ADN du domaine de pore dans TRPV2 L'ADNc a été obtenu en amplifiant 10ng de pCMV-TRPV2 avec la paire d'amorces: avant: 5'-ctggccttccaggagcagctgc 3 'et inverse: 5'-ggcattggggctctgtaggagc 3' par PCR en utilisant Pfu ADN polymérase (Stratagene, Milan, IT). Domaine des pores – supprimé TRPV2 la construction (pCMV-ΔpTRPV2) a été séquencée avant son utilisation dans des expériences de transfection.

Transfections cellulaires

siGENOME SMARTpools pour TRPV2 ( siTRPV2 ) consistant en quatre ciblages ARN duplex TRPV2 Le gène et un siCONTROL de petit ARN interférant non ciblant (siGLO) avec au moins quatre incompatibilités avec tout gène humain utilisé comme contrôle négatif ont été achetés chez Dharmacon (Lafayette, CO). Pour les expériences de transfection, des cellules de gliome U87MG et MZC ont été étalées à la densité de 3 x 10 4 /cm 2 et après une nuit d’incubation, 50nM de siTRPV2 ou siGLO et 1 µg / ml de pCMV- TRPV2 pCMV- TRPV2 Δp ou pCMV (vecteur vide) ont été ajoutés aux puits, conformément au protocole de transfection METAFECTENE Easy (Biontex Laboratories GmbH, Martinsried / Planegg, Allemagne).

Analyse Western blot

Les cellules de gliome ont été lysées dans du tampon de lyse comme décrit précédemment (7). Les fractions cellulaires de la membrane plasmique et du gliome du cytosol ont été isolées à l’aide du kit de fractionnement de protéine sous-cellulaire (Thermo Scientific, Rockford, IL), conformément aux instructions du fabricant. Vingt microgrammes de lysats ont été séparés sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 7% de sodium, transférés sur des membranes Hybond-C extra (GE Healthcare Europe GmbH, Milan, IT) et transférés avec l'anti-β-actine de souris spécifique (1: 1000; Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou l'anticorps de chèvre anti-TRPV2 (1: 200; Santa Cruz Biotechnology) suivi de l'anticorps secondaire respectif conjugué à la peroxydase de raifort, tel que précédemment publié (7). La spécificité des anticorps anti-TRPV2 a été évaluée comme décrit précédemment (17). En outre, les transferts ont été incubés avec l'anticorps secondaire. L'immunocoloration a été révélée par le système d'analyse Western Blotting par chimioluminescence améliorée (GE Healthcare). L'analyse densitométrique a été réalisée par ChemiDoc à l'aide du logiciel Quantity One (Bio-Rad).

Test de mobilisation du calcium

Pour l'analyse de l'influx de calcium, les cellules ont été remises en suspension dans un milieu salin / glucose tamponné avec un phosphate, exempt de calcium et de magnésium, additionné de 7 µmol / l de FLUO 3-AM (Invitrogen, Milan, IT) et de 1 µg / ml de Pluronic F-127 (molécule Molecular, Milan, IT) et incubés dans le noir pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2 . Après lavage, les cellules ont été remises en suspension dans un milieu salin / glucose tamponné au phosphate et exempt de calcium et de magnésium contenant 2 mmol / l de Ca 2+ réchauffé à 37 ° C et ont été stimulés avec différentes doses de CBD ou ont été prétraités pendant 30 min avec RR et ensuite traités avec du CBD. La fluorescence FLUO 3-AM a été mesurée toutes les 10 s sur le cytomètre en flux à 525 nm sur le canal vert (cytofluorimètre FACScan; BD Pharmingen, San Diego, Californie) en utilisant le logiciel CellQuest (BD Pharmingen). Le nombre d'événements acquis était ≈3 × 10 3 . (Californie 2+ ) je a été déterminée avant et après l’addition de diverses concentrations de composés à tester. Pour convertir les valeurs de fluorescence en (Ca 2+ ) je , une procédure de calibration a été réalisée pour chaque expérience.

L’équation suivante a été utilisée pour déterminer (Ca 2+ ) libre:

formule

,

K est la constante de FLUO-3 et correspond à 400nM, Fmin et Fmax sont les intensités de fluorescence de FLUO-3 sans ou avec maximum (Ca 2+ ) et F est la fluorescence moyenne de l'échantillon. Les cellules non stimulées ont été analysées pour établir les niveaux de fluorescence de base. Les courbes dose-réponse ont été conçues en traçant le maximum (Ca 2+ ) je valeurs pour chaque dose de CBD et de RR. CE 50 La valeur a été déterminée comme étant la concentration de CBD requise pour produire des augmentations semi-maximales de (Ca 2+ ) je . IC 50 La valeur a été déterminée en tant que concentration exerçant une inhibition semi-maximale des augmentations de (Ca 2+ ) je .

Dosage MTT

La viabilité des cellules a été mesurée par dosage du bromure de 3- (4,5-diméthylthiazole-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT). Environ 3 × 10 3 cellules / cm 2 ont été ensemencés dans une plaque à 96 puits puis traités avec différents médicaments pendant 3 jours maximum. Quatre répétitions ont été utilisées pour chaque traitement. Au moment indiqué, 0,8 mg / ml de MTT a été ajouté au milieu et incubé pendant 3h. Les surnageants ont ensuite été jetés et les cristaux de formazan colorés, dissous avec 100 ul / puits de diméthylsulfoxyde, ont été lus par un lecteur de dosage d'immunosorbants liés à une enzyme (BioTek Instruments, Bad Friedrichshall, Allemagne). Les données relatives au véhicule ont été omises lorsqu'aucun effet n'a été observé par rapport aux cellules non traitées.

Essai sur gélose douce

La formation de colonies a été évaluée dans des plaques à puits de 35 mm contenant deux couches de gélose molle. Des sous-couches de 500 microlitres d'agarose molle à 0,6% (agarose à plaque marine diluée dans du milieu) ont été préparées dans chaque puits. La couche supérieure a été réalisée en ajoutant 3 × 10 3 cellules / puits dans un mélange de deux tiers d'agarose molle à 0,4% et d'un tiers de milieu, dans un volume total de 500 µl. Pour l’étude du traitement médicamenteux, la couche cellulaire était composée de cellules tumorales, d’un mélange de deux tiers d’agarose mou à 0,4% et d’un tiers contenant du BCNU, du TMZ, du DOXO et du CBD. Les plaques ont été incubées à 37 ° C dans une solution à 5% de CO. 2 pendant 15 jours. Le nombre de colonies a été mesuré au microscope Olympus IX71.

Dosage de l'apoptose

L'exposition à la phosphatidylsérine sur les cellules de gliome U87MG et MZC a été détectée par coloration à l'annexine V et analyse cytofluorimétrique. En bref, 3 × 10 4 cellules / cm 2 ont été traités avec différentes doses de CBD pendant 1 jour ou avec une combinaison de CBD 10 µM et de médicaments chimiothérapeutiques pendant 6h. Après traitement, les cellules ont été colorées avec 5 µl d’isothiocyanate d’annexine V-fluorescéine pendant 10 min à température ambiante et lavées une fois avec du tampon de liaison (Hepes 10 mM / NaOH pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM). 2 ).

Absorption de la doxorubicine

Les cellules MZC transfectées ont été prétraitées avec RR ou EGTA pendant 30 minutes, puis du CBD a été ajouté pendant 30 minutes. Pour chaque traitement, une incubation avec DOXO 5 µM a été réalisée pendant 2 heures supplémentaires. Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un cytofluorimètre FACScan à l'aide du logiciel CellQuest, et l'intensité de la fluorescence a été exprimée en unités arbitraires à l'échelle logarithmique. Pour l'analyse microscopique, les cellules ont été traitées avec du DOXO 5 µM. L'imagerie cellulaire a été réalisée avec un microscope Olympus BX51.

analyses statistiques

La signification statistique a été déterminée par Student. t -test et test de Bonferroni (analyse de variance unidirectionnelle); P -les valeurs <0,01 ont été considérées comme significatives. IC 50 les valeurs rapportées dans cette étude ont été déterminées en calculant l'antilog de logIC 50 valeurs. Erreurs types pour IC 50 la valeur n'a pas été déterminée; en tant que telles valeurs ne sont pas directement corrélées avec logIC 50 erreurs types. Graphes et analyse statistique pour EC 50 et IC 50 ont été préparés avec Prism 5.0a (Graph Pad).

Résultats

Le CBD agit comme agoniste sélectif du TRPV2 dans les lignées cellulaires de gliome

Des rapports antérieurs ont démontré la capacité du CBD à induire un afflux de calcium dans les cellules HEK293 exprimant de manière transitoire le canal TRPV2 humain (CE 50 : 31,7 µM (18)). Ici, nous avons analysé la capacité du CBD à induire un afflux de calcium dans les cellules U87MG exprimant TRPV2, par dosage de la mobilisation du calcium. Comme représenté sur la Figure supplémentaire 1A , disponible à Cancérogenèse En ligne, l’augmentation de l’afflux de calcium induite par la CBD dans les cellules U87MG était fonction de la concentration, avec un CE 50 valeur de 22,2 µM. Cet effet a été inhibé par la pré-incubation avec le bloqueur spécifique du canal TRP, RR, qui présentait un IC. 50 3,25 µM lorsqu’il est testé en présence de CBD 25 µM ( Figure supplémentaire 1B , disponible à Cancérogenèse En ligne). Pour confirmer le rôle sélectif du CBD en tant qu’agoniste de TRPV2, nous avons utilisé un U87MG (U87MG siTRPV2 ) et une MZC transfectée transitoirement par TRPV2 (MZC TRPV2 ) modèles de lignée cellulaire ( Figure 1C et G supplémentaires , disponible à Cancérogenèse En ligne) (7).

Du fait que TRPV2 est localisé dans la membrane plasmique (M) et dans le cytoplasme (C) (17), nous avons d’abord isolé les fractions M et C des lignées U87MG et MZC transfectées, et la localisation de TRPV2 a été déterminée par analyse Western blot. Comme indiqué, nous avons trouvé que dans U87MG siTRPV2 , les taux de protéines TRPV2 inférieurs étaient exprimés par rapport à U87MG siGLO ( Figure 1C et D supplémentaires , disponible à Cancérogenèse En ligne). En mzc TRPV2 , une augmentation du niveau de TRPV2 a été constatée par rapport à MZC VIDE ( Figure supplémentaire 1G et H , disponible à Cancérogenèse En ligne). Dans les deux modèles de lignées cellulaires, TRPV2 a été détecté principalement dans la fraction M ( Figure supplémentaire 1D et H , disponible à Cancérogenèse En ligne). Par la suite, nous avons constaté que les taux de calcium basal étaient réduits chez les U87MG siTRPV2 cellules par rapport à U87MG siGLO cellules ( Figure 1E et F supplémentaires , disponible à Cancérogenèse Online), alors que des taux de calcium basaux élevés ont été observés dans MZC TRPV2 en ce qui concerne MZC VIDE cellules ( Figure supplémentaire 1I et L , disponible à Cancérogenèse En ligne). En outre, le traitement avec 25 µM de CBD a augmenté l'afflux de calcium dans le U87MG siGLO cellules ( Figure supplémentaire 1E , disponible à Cancérogenèse En ligne) et dans MZC TRPV2 cellules transfectées ( Figure supplémentaire 1L , disponible à Cancérogenèse En ligne). Enfin, 10 µM RR a inhibé les effets médiés par la CDB dans U87MG siGLO et MZC TRPV2 cellules ( Figure 1E et L supplémentaires , disponible à Cancérogenèse En ligne). Pour vérifier tout effet putatif de la transfection dans les réponses d'influx de calcium des lignées cellulaires U87MG et MZC, les lignées cellulaires transfectées et non transfectées ont été analysées par un test d'influx de calcium. Les résultats ont montré qu’aucune différence d’influx de calcium n’était observée entre les protéines U87MG et U87MG non transfectées. siGLO cellules de contrôle et entre MZC non transfectée et MZC transfectée VIDE cellules de contrôle (données non présentées).

Globalement, nos résultats démontrent que le CBD agit comme un agoniste sélectif du canal TRPV2 dans les cellules GBM humaines, en augmentant l'afflux de calcium.

Le CBD affecte la viabilité des cellules de gliome de manière dépendante du temps et de la dose

Ici, nous avons évalué la capacité du traitement par CBD à différentes doses (1 à 50 µM) et à différents moments (1 à 3 jours) d’affecter la viabilité et l’apoptose des cellules U87MG et MZC. Les résultats obtenus indiquent que le CBD à la dose > 25 µM ont réduit la viabilité des deux cellules de gliome de manière dépendante du temps à partir du jour 1 (U87MG, IC 50 = 30,2 µM; MZC, IC 50 = 33,2 µM, calculé au jour 1), en induisant la mort cellulaire apoptotique, alors que des doses de CBD < 10 µM n’a pas eu d’effets cytotoxiques et apoptotiques significatifs ( Figure supplémentaire 2 , disponible à Cancérogenèse En ligne). Ainsi, afin de déterminer l'activité biologique du CBD à une dose non toxique et neuroprotectrice (23), nous avons décidé d'utiliser le CBD à une dose de 10 µM dans toutes les expériences ultérieures.

Le CBD induit l'expression de l'ARNm et de la protéine TRPV2 et favorise sa localisation membranaire dans les cellules de gliome

Le rôle du CBD en tant que modulateur de la transcription génique a été décrit précédemment dans différentes lignées de cellules cancéreuses humaines (30, 31). Par conséquent, afin de déterminer l'aptitude du CBD (10 µM) à affecter l'expression de TRPV2, les niveaux d'ARNm et de protéines de TRPV2 ont été évalués par PCR quantitative en temps réel et par analyse Western blot, respectivement, dans des lignées cellulaires de gliomes traitées au CBD. Nous avons constaté que le CBD augmentait rapidement l'expression du transcrit TRPV2 (figures 1A et 1D) et de la protéine (figures 1B et 1E) dans les cellules U87MG et MZC de manière dépendante du temps, avec un pic le jour 1. De plus, conformément aux preuves (20), nous avons constaté que, également dans les cellules U87MG et MZC, TRPV2 se localise dans le cytosol et dans la membrane plasmique. De plus, nous avons constaté que les traitements à base de CBD augmentent principalement la localisation de TRPV2 au niveau de la membrane plasmique (figures 1C et 1F).

Fig. 1.

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Le CBD induit l'expression de TRPV2 dans les lignées cellulaires de gliomes. Les niveaux d’ARNm de TRPV2 ont été évalués par PCR duplex temps réel quantitative sur U87MG ( UNE ) et MZC ( ), après incubation avec du CBD (10 µM), jusqu’à 3 jours. L'expression relative de TRPV2 normalisée par rapport aux taux d'ARNm de la β-actine a été calculée en considérant le jour 0 d'incubation comme étalon. Les niveaux de protéine TRPV2 ont été évalués par analyse Western blot sur U87MG ( B ) et MZC ( E ) cellules après incubation avec du CBD (10 µM), comme ci-dessus. Les taux relatifs de protéine TRPV2 ont été déterminés en utilisant les taux de protéine β-actine comme contrôle de charge. * P <0,01 par rapport au jour 0. Toutes les données présentées sont la moyenne ± l'écart-type d'au moins trois expériences distinctes. Les immunoblots sont représentatifs d'une expérience sur trois réalisée avec des résultats similaires. Des immunoblots représentatifs de l’expression de la protéine TRPV2 dans les fractions de U87MG de la membrane plasmique, M, et du cytosolique, C ( C ) et MZC ( F ) les cellules traitées avec du CBD (10 µM) ont été montrées. Vingt microgrammes de protéines totales dans des extraits membranaires et des fractions cytoplasmiques ont été chargés sur le gel. Aucune réactivité n'a été observée en buvant avec l'anticorps secondaire seul, avec une IgG de chèvre normale et avec l'anticorps anti-TRPV2 pré-adsorbé avec son peptide de blocage (données non présentées).

Fig. 1.

<img class = "content-image" src = "https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0001.jpeg?Expires=156292307&lang=fr = KynGmUo8L90oOlkpdk2xTjLEbhsBsRv9CaKc7FOOCT7SG5fhtXw59HHpCxOS5SsplaT ~ MdHin-LlLouQg5MhC3nywAMr0GK5zkqz6zOXqDLxaUu5FzvKjnUDbtlZVo5SUu0TQxn0i1RLzshhjhLmwAXdhrw7VdglvrPNwHjahnuli4bXRqPU5ZD9U0z6iouBBrcUm20sgAGWWvjLSGnMxk1 ~ ojkL2xX2V1Q7R3twa399B6XdKeu2QbiUm9Cdo ~ OpOSFjnYAL7V6vpyLPNK5v5dlVXcaVF6ew00VOakAqtCL6CFMxtDMbAk7wGfmw ~ z7lD ~ N4gpFFh7YXJhmeZM2YlQ __ & Key-pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA "alt =" CBD induit l'expression de TRPV2 dans des lignées cellulaires de gliome. on a évalué les taux d'ARNm TRPV2 par duplex quantitative PCR en temps réel dans U87MG (A) et les cellules MZC (D), après incubation avec du CBD (10 µM), pendant 3 jours maximum. L’expression relative de TRPV2 normalisée aux taux d’ARNm de la β-actine a été calculée en considérant le jour 0 de l’incubation comme étalon. Les niveaux de protéine TRPV2 ont été évalués par analyse Western blot en U87MG (B) et MZC (E) cel Après incubation avec du CBD (10 µM), comme ci-dessus. Les taux relatifs de protéine TRPV2 ont été déterminés en utilisant les taux de protéine β-actine comme contrôle de charge. * P < 0.01 versus day 0. All the data shown are the mean ± SD of at least three separate experiments. Immunoblots are representative of one out of three experiments performed with similar results. Representative immunoblots of TRPV2 protein expression in plasma membrane, M, and cytosolic, C, fractions of U87MG ( C ) and MZC ( F ) cells treated with CBD (10 μM) were shown. Twenty micrograms of total protein in membrane extracts and cytoplasmic fractions were loaded on the gel. No reactivity was observed blotting with the secondary antibody alone, with normal goat IgG and with the anti-TRPV2 antibody pre-adsorbed with its blocking peptide (data not shown). " path-from-xml="carcin_bgs328_f0001.jpeg"/>

Le CBD induit l'expression de TRPV2 dans les lignées cellulaires de gliomes. Les niveaux d’ARNm de TRPV2 ont été évalués par PCR duplex temps réel quantitative sur U87MG ( UNE ) et MZC ( ), après incubation avec du CBD (10 µM), jusqu’à 3 jours. L'expression relative de TRPV2 normalisée par rapport aux taux d'ARNm de la β-actine a été calculée en considérant le jour 0 d'incubation comme étalon. Les niveaux de protéine TRPV2 ont été évalués par analyse Western blot sur U87MG ( B ) et MZC ( E ) cellules après incubation avec du CBD (10 µM), comme ci-dessus. Les taux relatifs de protéine TRPV2 ont été déterminés en utilisant les taux de protéine β-actine comme contrôle de charge. * P <0,01 par rapport au jour 0. Toutes les données présentées sont la moyenne ± l'écart-type d'au moins trois expériences distinctes. Les immunoblots sont représentatifs d'une expérience sur trois réalisée avec des résultats similaires. Des immunoblots représentatifs de l’expression de la protéine TRPV2 dans les fractions de U87MG de la membrane plasmique, M, et du cytosolique, C ( C ) et MZC ( F ) les cellules traitées avec du CBD (10 µM) ont été montrées. Vingt microgrammes de protéines totales dans des extraits membranaires et des fractions cytoplasmiques ont été chargés sur le gel. Aucune réactivité n'a été observée en buvant avec l'anticorps secondaire seul, avec une IgG de chèvre normale et avec l'anticorps anti-TRPV2 pré-adsorbé avec son peptide de blocage (données non présentées).

Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le CBD augmente l'expression de TRPV2, tant au niveau de l'ARNm que de celui des protéines dans les lignées cellulaires de gliomes.

Le CBD potentialise la cytotoxicité des agents chimiothérapeutiques de manière dépendante de TRPV2

Nous avons précédemment signalé que la surexpression de TRPV2 par transfection génique dans des cellules MZC augmente la sensibilité aux effets cytotoxiques induits par BCNU (7). En raison de l’augmentation des effets du CBD sur l’expression de TRPV2, nous avons évalué si le CBD (10 µM) co-administré avec différentes doses de BCNU (10 –5 – 10 –3 M), TMZ (10 –5 – 10 –2 M) et DOXO (10 –5 – 10 –3 M) a pu potentialiser leurs effets cytotoxiques dans les cellules de gliome. L’analyse de la relation dose-réponse (Figure 2) et de l’évolution dans le temps (Figures 3A et 3B) a révélé que, dans des cellules U87MG, la co-administration de CBD réduisait nettement la CI 50 valeurs de BCNU, TMZ ou DOXO en ce qui concerne le traitement avec l'agent chimiothérapeutique seul (médicament contre médicament + CBD: BCNU: 528 contre 183 µM; TMZ: 968 contre 397 µM; DOXO: 262 contre 142 µM) (Figure 2A). De même, dans les cellules MZC, la co-administration de CBD avec BCNU, TMZ et DOXO a également réduit la concentration de CI. 50 valeurs (médicament contre médicament + CBD: BCNU: 607 versus 275 µM; TMZ: 1113 versus 515 µM; DOXO: 473 contre 312 µM) (Figure 2B). De plus, le CBD utilisé en combinaison avec BCNU (200 µM), TMZ (400 µM) et DOXO (200 µM) a réduit le nombre de colonies formées évaluées par dosage sur gélose molle (Figure 2C). De plus, la co-administration de CBD avec TMZ, BCNU et DOXO a considérablement amélioré les effets pro-apoptotiques des médicaments utilisés seuls sur les cellules U87MG et MZC, évalués 6 heures après le traitement par l'annexine V-fluorescéine, coloration et analyse cytofluorimétrique (Figure 2D). . Ces données suggèrent fortement que les traitements à base de CBD entraînent une potentialisation des effets pro-apoptotiques induits par BCNU, TMZ ou DOXO.

Fig. 2

<img class = "content-image" src = "https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0002.jpeg?Expires=156292307&lang=fr = v6fTBZ ~ OoZ4uQXDfjlWukAFE6oaNJ9Sp0Y4eWu-zz937a5Ob9bZf8Ob5fRjKQn ~ AQVjUR7Znnk7p2hOlUBH67NqtrXaa ~ h4uQ3j6KUnFZ4NWOS2IXvdrQVHIgyX ~ Slxp9 ~ k63zpOd6AFCNqtiNIRy3xC69WpC9rr2bvcWo2VzNSLXfq8Z0PJd5Dcsh4t8jWqBv0qFoCU84csPptd8-iq-ZpLk ~ syPj-ahEtHsT1ELZ4CHB0d0cqrFE9R5dR6skn2E9HZnKe6u1xh8-QXuDyxtJjmmmwvVEsZ ~ 1a2ta4SOdkLBFUMuJ2ZvE31Zi4JHstBxgg13q8MNcp2AMAmYg1KdQ __ & Key-pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA "alt =" CBD potentialise cellules de gliome dépendant de TRPV2 chimiosensibilité. U87MG (A) et Des cellules MZC (B) ont été cultivées pendant 1 jour avec différentes doses de BCNU, TMZ ou DOXO seules ou en combinaison avec du CBD (10 µM). La viabilité cellulaire a été déterminée par dosage au MTT. Les données indiquées sont exprimées en moyenne ± écart-type de trois expériences distinctes. . (C) Les cellules U87MG et MZC ont été cultivées dans de la gélose molle pendant 14 jours et traitées avec du véhicule, du CBD (10 μM) seul. ou en association avec BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) ou DOXO (200 μM). Les dénombrements de colonies en gélose molle ont été effectués par trois chercheurs indépendants, visualisant au microscope des colonies individuelles dans 10 champs aléatoires. Les données présentées sont la moyenne ± SD du pourcentage de colonies par rapport au véhicule obtenu dans trois expériences séparées. * P <0,01 par rapport au véhicule. (D) Valeurs MFI de la coloration de l'isothiocyanate d'annexine V-fluorescéine dans des cellules de gliome U87MG et MZC, traitées pendant 6h avec des médicaments chimiothérapeutiques (BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) et DOXO (200 μM)) seules ou en combinaison avec du CBD (10 μM), ont été déterminés par immunofluorescence et par analyse de tri cellulaire activée par fluorescence. Les données présentées sont la moyenne ± SD de trois expériences séparées. * P < 0.01, BCNU/TMZ/DOXO versus vehicle and BCNU/TMZ/DOXO plus CBD versus BCNU/TMZ/DOXO, respectively. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0002.jpeg"/>

Le CBD potentialise la chimiosensibilité des cellules de gliome dépendant de TRPV2. U87MG ( UNE ) et MZC ( B ) les cellules ont été cultivées pendant 1 jour avec différentes doses de BCNU, TMZ ou DOXO seules ou en combinaison avec du CBD (10 µM). La viabilité cellulaire a été déterminée par dosage MTT. Les données présentées sont exprimées sous forme de moyenne ± SE de trois expériences distinctes. ( C ) Les cellules U87MG et MZC ont été cultivées dans de la gélose molle pendant 14 jours et traitées avec du véhicule, du CBD (10 μM) seul ou en combinaison avec du BCNU (200 μM), du TMZ (400 μM) ou du DOXO (200 μM). Les dénombrements de colonies en gélose molle ont été effectués par trois chercheurs indépendants, visualisant au microscope des colonies individuelles dans 10 champs aléatoires. Les données présentées sont la moyenne ± SD du pourcentage de colonies par rapport au véhicule obtenu dans trois expériences séparées. * P <0,01 par rapport au véhicule. ( ) Valeurs MFI de la coloration à l'isothiocyanate d'annexine V-fluorescéine dans des cellules de gliome U87MG et MZC, traitées pendant 6h avec des médicaments chimiothérapeutiques (BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) et DOXO (200 μM)) seules ou en combinaison avec du CBD (10 µM), ont été déterminés par immunofluorescence et par analyse de tri cellulaire activée par fluorescence. Les données présentées sont la moyenne ± SD de trois expériences séparées. * P <0,01, BCNU / TMZ / DOXO par rapport au véhicule et BCNU / TMZ / DOXO plus CBD par rapport à BCNU / TMZ / DOXO, respectivement.

Fig. 2

<img class = "content-image" src = "https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0002.jpeg?Expires=156292307&lang=fr = v6fTBZ ~ OoZ4uQXDfjlWukAFE6oaNJ9Sp0Y4eWu-zz937a5Ob9bZf8Ob5fRjKQn ~ AQVjUR7Znnk7p2hOlUBH67NqtrXaa ~ h4uQ3j6KUnFZ4NWOS2IXvdrQVHIgyX ~ Slxp9 ~ k63zpOd6AFCNqtiNIRy3xC69WpC9rr2bvcWo2VzNSLXfq8Z0PJd5Dcsh4t8jWqBv0qFoCU84csPptd8-iq-ZpLk ~ syPj-ahEtHsT1ELZ4CHB0d0cqrFE9R5dR6skn2E9HZnKe6u1xh8-QXuDyxtJjmmmwvVEsZ ~ 1a2ta4SOdkLBFUMuJ2ZvE31Zi4JHstBxgg13q8MNcp2AMAmYg1KdQ __ & Key-pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA "alt =" CBD potentialise cellules de gliome dépendant de TRPV2 chimiosensibilité. U87MG (A) et Des cellules MZC (B) ont été cultivées pendant 1 jour avec différentes doses de BCNU, TMZ ou DOXO seules ou en combinaison avec du CBD (10 µM). La viabilité cellulaire a été déterminée par dosage au MTT. Les données indiquées sont exprimées en moyenne ± écart-type de trois expériences distinctes. . (C) Les cellules U87MG et MZC ont été cultivées dans de la gélose molle pendant 14 jours et traitées avec du véhicule, du CBD (10 μM) seul. ou en association avec BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) ou DOXO (200 μM). Les dénombrements de colonies en gélose molle ont été effectués par trois chercheurs indépendants, visualisant au microscope des colonies individuelles dans 10 champs aléatoires. Les données présentées sont la moyenne ± SD du pourcentage de colonies par rapport au véhicule obtenu dans trois expériences séparées. * P <0,01 par rapport au véhicule. (D) Valeurs MFI de la coloration de l'isothiocyanate d'annexine V-fluorescéine dans des cellules de gliome U87MG et MZC, traitées pendant 6h avec des médicaments chimiothérapeutiques (BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) et DOXO (200 μM)) seules ou en combinaison avec du CBD (10 μM), ont été déterminés par immunofluorescence et par analyse de tri cellulaire activée par fluorescence. Les données présentées sont la moyenne ± SD de trois expériences séparées. * P < 0.01, BCNU/TMZ/DOXO versus vehicle and BCNU/TMZ/DOXO plus CBD versus BCNU/TMZ/DOXO, respectively. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0002.jpeg"/>

Le CBD potentialise la chimiosensibilité des cellules de gliome dépendant de TRPV2. U87MG ( UNE ) et MZC ( B ) les cellules ont été cultivées pendant 1 jour avec différentes doses de BCNU, TMZ ou DOXO seules ou en combinaison avec du CBD (10 µM). La viabilité cellulaire a été déterminée par dosage MTT. Les données présentées sont exprimées sous forme de moyenne ± SE de trois expériences distinctes. ( C ) U87MG and MZC cells were grown in soft agar for 14 days and treated with vehicle, CBD (10 μM) alone or in combination with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) or DOXO (200 μM). Soft agar colony counts were done by three independent investigators microscopically visualizing individual colonies in 10 random fields. Data shown are the mean ± SD of the percentage of colonies with respect to vehicle obtained in three separate experiments. * P < 0.01 versus vehicle. ( ) MFI values of annexin V-fluorescein isothiocyanate staining in U87MG and MZC glioma cells, treated for 6h with chemotherapeutic drugs (BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) and DOXO (200 μM)) alone or in combination with CBD (10 μM), were determined by immunofluorescence and fluorescence-activated cell sorting analysis. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01, BCNU/TMZ/DOXO versus vehicle and BCNU/TMZ/DOXO plus CBD versus BCNU/TMZ/DOXO, respectively.

Fig. 3.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0003.jpeg?Expires=1562923047&Signature=RDGIzFZFnkRhEkUNPpYVDQpLLBNjruUbZc1Zl8Qg82FlHp~pGe6L2qXH1TYoXdXBaU2cEfBtNIxwRQDTnQ9UpCYhceKU5HvOqUtF-RWMzf~ufSCMnQDIOLgHAQoiQW7A25~BwPzetCjAilfd0BWL-0-ual9gm~4NGJVae5Yox5F2KAns0LsJ2NHS9IX7WbD4TiRrGMFf1SnL0dTlyVVPpt71M62lFIymKdps0sKhEuu7QXpdhR6dzR9Wdlckuz7a7CUSg6OkciAFf91EkvQzpXLMoEFUrs-5-qlUQbUb9PVAwCbrkRQ9k-ucjAaO0S-dSWd1hCGto683whbCebp2iw__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" CBD decreases viability in U87MG and MZC cell lines up to 3 days. U87MG ( A ), MZC ( B ) and NHA ( C ) were cultured for up to 3 days with TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) and DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM). Cell viability was determined by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO versus vehicle, BCNU plus CBD versus BCNU, TMZ plus CBD versus TMZ and DOXO plus CBD versus DOXO. Vehicle data were omitted because no effects were observed with respect to untreated cells. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0003.jpeg"/>

CBD decreases viability in U87MG and MZC cell lines up to 3 days. U87MG ( UNE ), MZC ( B ) and NHA ( C ) were cultured for up to 3 days with TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) and DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM). Cell viability was determined by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO versus vehicle, BCNU plus CBD versus BCNU, TMZ plus CBD versus TMZ and DOXO plus CBD versus DOXO. Vehicle data were omitted because no effects were observed with respect to untreated cells.

Fig. 3.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0003.jpeg?Expires=1562923047&Signature=RDGIzFZFnkRhEkUNPpYVDQpLLBNjruUbZc1Zl8Qg82FlHp~pGe6L2qXH1TYoXdXBaU2cEfBtNIxwRQDTnQ9UpCYhceKU5HvOqUtF-RWMzf~ufSCMnQDIOLgHAQoiQW7A25~BwPzetCjAilfd0BWL-0-ual9gm~4NGJVae5Yox5F2KAns0LsJ2NHS9IX7WbD4TiRrGMFf1SnL0dTlyVVPpt71M62lFIymKdps0sKhEuu7QXpdhR6dzR9Wdlckuz7a7CUSg6OkciAFf91EkvQzpXLMoEFUrs-5-qlUQbUb9PVAwCbrkRQ9k-ucjAaO0S-dSWd1hCGto683whbCebp2iw__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" CBD decreases viability in U87MG and MZC cell lines up to 3 days. U87MG ( A ), MZC ( B ) and NHA ( C ) were cultured for up to 3 days with TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) and DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM). Cell viability was determined by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO versus vehicle, BCNU plus CBD versus BCNU, TMZ plus CBD versus TMZ and DOXO plus CBD versus DOXO. Vehicle data were omitted because no effects were observed with respect to untreated cells. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0003.jpeg"/>

CBD decreases viability in U87MG and MZC cell lines up to 3 days. U87MG ( UNE ), MZC ( B ) and NHA ( C ) were cultured for up to 3 days with TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) and DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM). Cell viability was determined by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO versus vehicle, BCNU plus CBD versus BCNU, TMZ plus CBD versus TMZ and DOXO plus CBD versus DOXO. Vehicle data were omitted because no effects were observed with respect to untreated cells.

Previously, it was demonstrated that alkylating agents did not affect NHAs survival, indicating a diversity of chemotherapeutic responses in NHA cells with respect to glioma cells ( 32–34 ). So, to ascribe a potential glioma-selective toxicity of CBD plus chemotherapeutic agents, we evaluated these treatments in NHA cells by MTT assay. As shown, no significant cytotoxic effects were observed in NHA ( Figure 3C ) with respect to U87MG ( Figure 3A ) and MZC ( Figure 3B ) cell lines, suggesting that NHA cells were refractory to CBD modulation.

We also observed that the CBD-mediated effects were TRP dependent, as shown by the ability of the specific TRP antagonist RR (10 µM) to completely abrogate the adjuvant effect induced by CBD ( Figure 4A and 4B ). No major effects were found by using the RR antagonist alone. To evaluate more directly the specific role of TRPV2 channel, we determined the effects of CBD in combination with the chemotherapeutic agents in U87MG siTRPV2 – and MZC TRPV2 -transfected cells. We found that knock-down of TRPV2 gene completely reverted the CBD-induced potentiation of BCNU-, TMZ- or DOXO-mediated cytotoxic effects in U87MG siTRPV2 cells ( Figure 4C ), whereas the co-administration of CBD with BCNU, TMZ or DOXO in MZC TRPV2 cells enhanced their cytotoxic effects that were reverted by RR administration ( Figure 4D ). No differences were found between U87MG and U87MG siGLO and between untransfected and transfected MZC EMPTY control cells (data not shown).

Fig. 4.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0004.jpeg?Expires=1562923047&Signature=TydBIFhrbQbkhwg~4jQ3ss4YU49A5A1iFfWZO~g3TN2k7szWIJAvGEUSubvBPzASmQn~BiTj4zwmFCRhOk9Exsnx61qrlHaYT~k6jLWhOsYBflns70URgUaV769bwX06AnY3vcIO6gw49KZ7ZAo~dODw6TFbui4cvei9l0Fzj9MBC9RSkz9~IT9UDqLqNCvEFprj71n2memk5ATBVGN9l-d5MXz07H4hUT55uQ2BUsfXAHV~jMvXQf6zGTBAbNAPF1LgqnElQZ6VJV4JE0FUYbaNDQdRVzlORKQG2DoLpHAWoPHk8QDmq3XFI3rHHwZFvcGVmarFu2t6kdq9OkCvFg__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" CBD effects are TRPV2 dependent. U87MG ( A ), MZC ( B ), U87MGsiTRPV2 ( C ) and MZC TRPV2 ( D ) were treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) or DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the pore blocker RR (10 μM), and cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO plus CBD/RR versus BCNU/TMZ/DOXO alone and BCNU/TMZ/DOXO plus CBD plus RR versus BCNU/TMZ/DOXO plus CBD. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0004.jpeg"/>

CBD effects are TRPV2 dependent. U87MG ( UNE ), MZC ( B ), U87MGsiTRPV2 ( C ) and MZC TRPV2 ( ) were treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) or DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the pore blocker RR (10 μM), and cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO plus CBD/RR versus BCNU/TMZ/DOXO alone and BCNU/TMZ/DOXO plus CBD plus RR versus BCNU/TMZ/DOXO plus CBD.

Fig. 4.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0004.jpeg?Expires=1562923047&Signature=TydBIFhrbQbkhwg~4jQ3ss4YU49A5A1iFfWZO~g3TN2k7szWIJAvGEUSubvBPzASmQn~BiTj4zwmFCRhOk9Exsnx61qrlHaYT~k6jLWhOsYBflns70URgUaV769bwX06AnY3vcIO6gw49KZ7ZAo~dODw6TFbui4cvei9l0Fzj9MBC9RSkz9~IT9UDqLqNCvEFprj71n2memk5ATBVGN9l-d5MXz07H4hUT55uQ2BUsfXAHV~jMvXQf6zGTBAbNAPF1LgqnElQZ6VJV4JE0FUYbaNDQdRVzlORKQG2DoLpHAWoPHk8QDmq3XFI3rHHwZFvcGVmarFu2t6kdq9OkCvFg__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" CBD effects are TRPV2 dependent. U87MG ( A ), MZC ( B ), U87MGsiTRPV2 ( C ) and MZC TRPV2 ( D ) were treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) or DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the pore blocker RR (10 μM), and cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO plus CBD/RR versus BCNU/TMZ/DOXO alone and BCNU/TMZ/DOXO plus CBD plus RR versus BCNU/TMZ/DOXO plus CBD. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0004.jpeg"/>

CBD effects are TRPV2 dependent. U87MG ( UNE ), MZC ( B ), U87MGsiTRPV2 ( C ) and MZC TRPV2 ( ) were treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) or DOXO (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the pore blocker RR (10 μM), and cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO plus CBD/RR versus BCNU/TMZ/DOXO alone and BCNU/TMZ/DOXO plus CBD plus RR versus BCNU/TMZ/DOXO plus CBD.

CBD increases DOXO uptake in a TRPV2-dependent manner

Selective introduction of xenobiotics into target cells by permeation through TRP channels has been reported ( 35 ). DOXO, a naturally occurring fluorescent anthracycline ( 36 ) with relatively small molecular weight (MW: 580), may represent a good tracer to study drug influx via TRP channels or large pore cation channels, allowing the analysis of the cellular trafficking of other small molecular weight chemotherapeutics drugs, including BCNU (MW: 214) and TMZ (MW: 194).

Therefore, we investigated whether the TRPV2-dependent potentiation of cytotoxic effects could be the result of TRPV2 activation induced by CBD and increased drug uptake into glioma cells. Thus, MZC EMPTY – and MZC TRPV2 -transfected cells were exposed for 2h to spontaneously fluorescent DOXO, and fluorescent emission was evaluated by immunofluorescence and fluorescence-activated cell sorting analysis. We observed a marked DOXO uptake in MZC TRPV2 cells, but not in MZC EMPTY cells ( Figure 5A ). No major differences were found by comparing the DOXO uptake in untransfected and MZC EMPTY -transfected cells (data not shown). We also evaluated the effect of CBD in DOXO-treated MZC TRPV2 cellules. We found a strong increase of red fluorescence with respect to untreated MZC TRPV2 cells ( Figure 5A ). Moreover, fluorescence-activated cell sorting analysis indicated that CBD can also increase the number of DOXO-positive cells in MZC TRPV2 , compared with cells treated with DOXO alone ( Figure 5B ). In addition, after drug removal followed by 24h culture, we found that DOXO was still retained ( Figure 5C ). Finally, the pore-specific antagonist RR (10 µM) completely reverted the increase of red mean fluorescence intensity (MFI) induced by CBD in MZC TRPV2 cells ( Figure 5D ).

Fig. 5.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0005.jpeg?Expires=1562923047&Signature=b2-X~bhcBFfT9ww98qgOYkRkOvTqwZyfHJuwekCiRGbhZGztZyfvdzr367~TNzrNR65znomK4Hi~b~ihaZIbxeEbNtGL9VaB7TYhawbXAE597NmPnN~Sc68Ix3dghkljBNqFxMcWda~yPVm8GGKf7Za4Np~KDjMmwkPL6o8UygymgFiiGqmYtG7Y9x7E7PEFHK0oDhk0sAAfFppc0tu2SU0XxyK6TAjECyQSbtokWnBzZdhYEOFL6yN3KeVETSLB6deDiKx1q7yCwoO~0kjFG7nlKsK18A~mCzTPvbu2DVxx6aNUJC~BQqBfdAWAftAT7eDOaforeQgEkuLYAk3Q-w__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" TRPV2 regulates DOXO uptake. ( A ) Cytofluorimetric profile of MZC EMPTY and MZC TRPV2 cells untreated (Control, white area) or after 2h of exposure to 5 μM DOXO alone or DOXO plus CBD (10 μM) (Uptake, gray area). The data shown are representative of three separate experiments and are expressed as MFI by subtracting the MFI of untreated to that of treated cells. ( B ) MZC TRPV2 cells were treated with DOXO or CBD plus DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Numbers indicate the percentage of positive cells in CBD plus DOXO-treated cells (white area) with respect to DOXO-treated cells (gray area). ( C ) MZC TRPV2 cells were treated with 5 μM DOXO for 2h, and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis (white area); then, the culture medium was refreshed, and DOXO retention was evaluated after 24h (gray area). ( D ) MZC TRPV2 cells were pretreated with 10 μM RR, 10 μM CBD and 1mM EGTA, incubated with DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Data shown are the MFI fold increase of each treatment with respect to the MFI of the untreated cells and correspond to the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus RR and DOXO plus EGTA, DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO; DOXO plus RR plus CBD versus DOXO plus CBD; DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD. ( E ) MZC TRPV2 cells were treated for 1 day with DOXO (200 μM), TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the Ca 2+ chelator, EGTA (1mM). Cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO alone and DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0005.jpeg"/>

TRPV2 regulates DOXO uptake. ( UNE ) Cytofluorimetric profile of MZC EMPTY and MZC TRPV2 cells untreated (Control, white area) or after 2h of exposure to 5 μM DOXO alone or DOXO plus CBD (10 μM) (Uptake, gray area). The data shown are representative of three separate experiments and are expressed as MFI by subtracting the MFI of untreated to that of treated cells. ( B ) MZC TRPV2 cells were treated with DOXO or CBD plus DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Numbers indicate the percentage of positive cells in CBD plus DOXO-treated cells (white area) with respect to DOXO-treated cells (gray area). ( C ) MZC TRPV2 cells were treated with 5 μM DOXO for 2h, and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis (white area); then, the culture medium was refreshed, and DOXO retention was evaluated after 24h (gray area). ( ) MZC TRPV2 cells were pretreated with 10 μM RR, 10 μM CBD and 1mM EGTA, incubated with DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Data shown are the MFI fold increase of each treatment with respect to the MFI of the untreated cells and correspond to the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus RR and DOXO plus EGTA, DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO; DOXO plus RR plus CBD versus DOXO plus CBD; DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD. ( E ) MZC TRPV2 cells were treated for 1 day with DOXO (200 μM), TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the Ca 2+ chelator, EGTA (1mM). Cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO alone and DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD.

Fig. 5.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0005.jpeg?Expires=1562923047&Signature=b2-X~bhcBFfT9ww98qgOYkRkOvTqwZyfHJuwekCiRGbhZGztZyfvdzr367~TNzrNR65znomK4Hi~b~ihaZIbxeEbNtGL9VaB7TYhawbXAE597NmPnN~Sc68Ix3dghkljBNqFxMcWda~yPVm8GGKf7Za4Np~KDjMmwkPL6o8UygymgFiiGqmYtG7Y9x7E7PEFHK0oDhk0sAAfFppc0tu2SU0XxyK6TAjECyQSbtokWnBzZdhYEOFL6yN3KeVETSLB6deDiKx1q7yCwoO~0kjFG7nlKsK18A~mCzTPvbu2DVxx6aNUJC~BQqBfdAWAftAT7eDOaforeQgEkuLYAk3Q-w__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" TRPV2 regulates DOXO uptake. ( A ) Cytofluorimetric profile of MZC EMPTY and MZC TRPV2 cells untreated (Control, white area) or after 2h of exposure to 5 μM DOXO alone or DOXO plus CBD (10 μM) (Uptake, gray area). The data shown are representative of three separate experiments and are expressed as MFI by subtracting the MFI of untreated to that of treated cells. ( B ) MZC TRPV2 cells were treated with DOXO or CBD plus DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Numbers indicate the percentage of positive cells in CBD plus DOXO-treated cells (white area) with respect to DOXO-treated cells (gray area). ( C ) MZC TRPV2 cells were treated with 5 μM DOXO for 2h, and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis (white area); then, the culture medium was refreshed, and DOXO retention was evaluated after 24h (gray area). ( D ) MZC TRPV2 cells were pretreated with 10 μM RR, 10 μM CBD and 1mM EGTA, incubated with DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Data shown are the MFI fold increase of each treatment with respect to the MFI of the untreated cells and correspond to the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus RR and DOXO plus EGTA, DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO; DOXO plus RR plus CBD versus DOXO plus CBD; DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD. ( E ) MZC TRPV2 cells were treated for 1 day with DOXO (200 μM), TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the Ca 2+ chelator, EGTA (1mM). Cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO alone and DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD. " path-from-xml="carcin_bgs328_f0005.jpeg"/>

TRPV2 regulates DOXO uptake. ( UNE ) Cytofluorimetric profile of MZC EMPTY and MZC TRPV2 cells untreated (Control, white area) or after 2h of exposure to 5 μM DOXO alone or DOXO plus CBD (10 μM) (Uptake, gray area). The data shown are representative of three separate experiments and are expressed as MFI by subtracting the MFI of untreated to that of treated cells. ( B ) MZC TRPV2 cells were treated with DOXO or CBD plus DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Numbers indicate the percentage of positive cells in CBD plus DOXO-treated cells (white area) with respect to DOXO-treated cells (gray area). ( C ) MZC TRPV2 cells were treated with 5 μM DOXO for 2h, and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis (white area); then, the culture medium was refreshed, and DOXO retention was evaluated after 24h (gray area). ( ) MZC TRPV2 cells were pretreated with 10 μM RR, 10 μM CBD and 1mM EGTA, incubated with DOXO as above described and the uptake was evaluated by cytofluorimetric analysis. Data shown are the MFI fold increase of each treatment with respect to the MFI of the untreated cells and correspond to the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus RR and DOXO plus EGTA, DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO; DOXO plus RR plus CBD versus DOXO plus CBD; DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD. ( E ) MZC TRPV2 cells were treated for 1 day with DOXO (200 μM), TMZ (400 μM), BCNU (200 μM) alone or in combination with CBD (10 μM) and the Ca 2+ chelator, EGTA (1mM). Cell viability was measured by MTT assay. Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 DOXO plus CBD, DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO alone and DOXO plus EGTA and DOXO plus EGTA plus CBD versus DOXO plus CBD.

In order to analyze the role of Ca 2+ influx in CBD-induced TRPV2-mediated increase in DOXO uptake and pro-apoptotic effects, MZC TRPV2 cells were incubated in the presence of the Ca 2+ chelator EGTA (1mM) alone or in combination with CBD. We found that EGTA completely inhibited the CBD induced increase of DOXO uptake ( Figure 5D ) and cytotoxicity ( Figure 5E ) in MZC TRPV2 cellules. Similar findings were obtained in MZC TRPV2 in response to the combined treatment of CBD with TMZ or BCNU ( Figure 5E ). In addition, a reduced effect of drugs in combination with EGTA was found in MZC TRPV2 , indicating that Ca 2+ depletion influences alkylating effects, as shown previously (37,38).

These results suggest that CBD by activating TRPV2 channels significantly enhances drug influx and retention in glioma cells.

TRPV2 pore domain regulates CBD-mediated TRPV2-induced drug uptake and cytotoxicity in glioma cells.

Pore structure plays a crucial role in determining the TRP channel permeation and selectively properties of TRPV channels ( 8 ). However, little is known about the structure of human TRPV2 channel, and the structural organization of its cation-selective pore is still poorly understood ( 39 ).

In order to evaluate the role of the TRPV2 pore domain in the CBD-induced effects, we generated a construct expressing a TRPV2 protein (pCMV Δp TRPV2 ) lacking the complete pore domain region (572–609 aa) ( Figure 6A ). As evaluated by western blot analysis, transfection of pCMV ΔpTRPV2 in MZC cells (MZC ΔpTRPV2 ) led to the expression of a short TRPV2 protein of about 82 kD ( Figure 6B ) both in the cytosol and in plasma membrane ( Figure 6C ). Deletion of the pore domain in MZC ΔpTRPV2 cells was accompanied by the failure of CBD to increase (Ca 2+ ) je influx ( Figure 6D ), by reduction of DOXO uptake ( Figure 6E ) and complete abrogation of the TRPV2-dependent potentiation of cytotoxic activity ( Figure 6F ), as compared with MZC TRPV2 cellules. These data confirmed previous observations in HEK293 cells transfected with hTRPV2 ( 20 ), showing that the pore domain of TRPV2 channel is involved in TRPV2-dependent effects, including Ca 2+ influx. Moreover, we demonstrated that TRPV2 pore domain regulates drug uptake with a consequent potentiation of BCNU, TMZ and DOXO cytotoxic activity in glioma cells.

Fig. 6.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0006.jpeg?Expires=1562923048&Signature=zIB8j8mGZFY2LpywpGZZqhr~okIvSQYXcS8ZpIGx7MclVJywN5MWVzPRqj~xByM2~oB60DHP8OVnyftsJ7oqGeBXuTRWjCn6NU~gHxiueN7Sk~xPz8fMIrIuPPHF0tkkA~cH0TfGLyVOOT2yihx5qP-eFHays6vaJ5kmBb0ckppwDrHup0dYSRHd0hWyPYayY0KMoi4vBL206WcX4JVXJoHqKfsjH-sxJNsbukO5im1VXj3bY8Gmi60fqXzy6qQIF6rho3rVwv9PoRk0HbUm~3k1smdfYciJAgnFrE6fmLwoHjqc0onW1i8WUKmLh1uilmg2f0CmXdBmzcJHw7YLlw__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" TRPV2 pore domain deletion regulates DOXO uptake and reverts CBD-mediated effects. ( A ) Schematic representation of TRPV2 protein with the deleted pore region (dotted line). The corresponding pore amino acid sequence is shown. ( B ) Lysates from MZC EMPTY and MZC ΔpTRPV2 cells were analyzed by immunoblot for TRPV2. Immunoblot is representative of three separate experiments with similar results. ( C ) Representative immunoblot of TRPV2 protein expression in cytosolic, C, and plasma membrane, M, fractions of MZC ΔpTRPV2 cells was shown. Twenty micrograms of total protein in membrane extracts and cytoplasmic fractions were loaded on the gel. ( D ) MZCΔpTRPV2cells were treated with CBD (25 μM) and the calcium influx was measured by monitoring fluo 3-AM. Data are representative of at least three independent experiments. ( E ) Representative images of MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated with DOXO (5 μM) for 2h. The uptake was evaluated by fluorescent microscopy analysis (magnification ×40, bar 20 μm). ( F ) Cell viability analysis was performed on MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) and DOXO (200 μM). Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO in MZC TRPV2 versus BCNU/TMZ/DOXO in MZC EMPTY . " path-from-xml="carcin_bgs328_f0006.jpeg"/>

TRPV2 pore domain deletion regulates DOXO uptake and reverts CBD-mediated effects. ( UNE ) Schematic representation of TRPV2 protein with the deleted pore region (dotted line). The corresponding pore amino acid sequence is shown. ( B ) Lysates from MZC EMPTY and MZC ΔpTRPV2 cells were analyzed by immunoblot for TRPV2. Immunoblot is representative of three separate experiments with similar results. ( C ) Representative immunoblot of TRPV2 protein expression in cytosolic, C, and plasma membrane, M, fractions of MZC ΔpTRPV2 cells was shown. Twenty micrograms of total protein in membrane extracts and cytoplasmic fractions were loaded on the gel. ( ) MZCΔpTRPV2cells were treated with CBD (25 μM) and the calcium influx was measured by monitoring fluo 3-AM. Data are representative of at least three independent experiments. ( E ) Representative images of MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated with DOXO (5 μM) for 2h. The uptake was evaluated by fluorescent microscopy analysis (magnification ×40, bar 20 μm). ( F ) Cell viability analysis was performed on MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) and DOXO (200 μM). Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO in MZC TRPV2 versus BCNU/TMZ/DOXO in MZC EMPTY .

Fig. 6.

<img class="content-image" src="https://oup.silverchair-cdn.com/oup/backfile/Content_public/Journal/carcin/34/1/10.1093_carcin_bgs328/2/m_carcin_bgs328_f0006.jpeg?Expires=1562923048&Signature=zIB8j8mGZFY2LpywpGZZqhr~okIvSQYXcS8ZpIGx7MclVJywN5MWVzPRqj~xByM2~oB60DHP8OVnyftsJ7oqGeBXuTRWjCn6NU~gHxiueN7Sk~xPz8fMIrIuPPHF0tkkA~cH0TfGLyVOOT2yihx5qP-eFHays6vaJ5kmBb0ckppwDrHup0dYSRHd0hWyPYayY0KMoi4vBL206WcX4JVXJoHqKfsjH-sxJNsbukO5im1VXj3bY8Gmi60fqXzy6qQIF6rho3rVwv9PoRk0HbUm~3k1smdfYciJAgnFrE6fmLwoHjqc0onW1i8WUKmLh1uilmg2f0CmXdBmzcJHw7YLlw__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt=" TRPV2 pore domain deletion regulates DOXO uptake and reverts CBD-mediated effects. ( A ) Schematic representation of TRPV2 protein with the deleted pore region (dotted line). The corresponding pore amino acid sequence is shown. ( B ) Lysates from MZC EMPTY and MZC ΔpTRPV2 cells were analyzed by immunoblot for TRPV2. Immunoblot is representative of three separate experiments with similar results. ( C ) Representative immunoblot of TRPV2 protein expression in cytosolic, C, and plasma membrane, M, fractions of MZC ΔpTRPV2 cells was shown. Twenty micrograms of total protein in membrane extracts and cytoplasmic fractions were loaded on the gel. ( D ) MZCΔpTRPV2cells were treated with CBD (25 μM) and the calcium influx was measured by monitoring fluo 3-AM. Data are representative of at least three independent experiments. ( E ) Representative images of MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated with DOXO (5 μM) for 2h. The uptake was evaluated by fluorescent microscopy analysis (magnification ×40, bar 20 μm). ( F ) Cell viability analysis was performed on MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) and DOXO (200 μM). Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO in MZC TRPV2 versus BCNU/TMZ/DOXO in MZC EMPTY . " path-from-xml="carcin_bgs328_f0006.jpeg"/>

TRPV2 pore domain deletion regulates DOXO uptake and reverts CBD-mediated effects. ( UNE ) Schematic representation of TRPV2 protein with the deleted pore region (dotted line). The corresponding pore amino acid sequence is shown. ( B ) Lysates from MZC EMPTY and MZC ΔpTRPV2 cells were analyzed by immunoblot for TRPV2. Immunoblot is representative of three separate experiments with similar results. ( C ) Representative immunoblot of TRPV2 protein expression in cytosolic, C, and plasma membrane, M, fractions of MZC ΔpTRPV2 cells was shown. Twenty micrograms of total protein in membrane extracts and cytoplasmic fractions were loaded on the gel. ( ) MZCΔpTRPV2cells were treated with CBD (25 μM) and the calcium influx was measured by monitoring fluo 3-AM. Data are representative of at least three independent experiments. ( E ) Representative images of MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated with DOXO (5 μM) for 2h. The uptake was evaluated by fluorescent microscopy analysis (magnification ×40, bar 20 μm). ( F ) Cell viability analysis was performed on MZC EMPTY , MZC TRPV2 and MZC ΔpTRPV2 cells treated for 1 day with BCNU (200 μM), TMZ (400 μM) and DOXO (200 μM). Data shown are the mean ± SD of three separate experiments. * P < 0.01 BCNU/TMZ/DOXO in MZC TRPV2 versus BCNU/TMZ/DOXO in MZC EMPTY .

Discussion

Poor chemosensitivity and development of chemoresistance remain the major obstacles to successful chemotherapy of GBM ( 1 ). Standard therapies consist of surgery followed by radiotherapy and chemotherapy with alkylating agents, including BCNU and TMZ that readily cross the blood–brain barrier ( 1 ). However, despite the ability of these chemotherapeutic agents to achieve therapeutic concentrations in the brain, GBM are often resistant to these agents ( 3 ). Thus, the identification of the mechanisms responsible for the chemoresistance operating in human GBM and the development of novel approaches to overcome resistance represent the major focus of ongoing research ( 3 , 4) .

Herein, we provide evidence that treatment with the TRPV2 agonist CBD, by enhancing TRPV2 expression and activation, increases the chemosensitivity of human GBM cells to the cytotoxic effects of the chemotherapeutic agents BCNU, TMZ and DOXO.

Firstly, as evaluated by calcium mobilization assay, we found that CBD increases the (Ca 2+ ) je influx in TRPV2-expressing U87MG cells and that this effect was completely abrogated by treatment with the TRP channel antagonist RR. In addition, over-expression of TRPV2 channel in MZC cells resulted in marked enhancement of the CBD-induced (Ca 2+ )i influx, whereas knock-down of TRPV2 completely inhibited the CBD-mediated effects in U87MG, demonstrating that CBD represents a selective TRPV2 agonist in human glioma cells.

We have previously reported that reduction or complete loss of TRPV2 expression is associated with GBM progression and high resistance of U87MG and MZC glioma cell lines to BCNU ( 7 ). Herein, we demonstrate that CBD reduces the chemoresistance of glioma cells to TMZ, BCNU or DOXO, by increasing TRPV2 expression both at mRNA and protein levels. Indeed, a marked reduction of drug IC 50 values and numbers of colonies formed in soft agar associated with an increased number of apoptotic cells was evidenced in CBD plus chemotherapeutic-treated glioma cells. These effects were TRP dependent, as evaluated by the ability of the TRP channel antagonist RR to completely revert the CBD-mediated effects. Moreover, we directly demonstrated the involvement of the TRPV2 channel in the CBD-mediated promotion of drug cytotoxic effects by either silencing or over-expressing the TRPV2 gene in U87MG and MZC cells, respectively. Knock-down of TRPV2 expression by small interfering RNA completely inhibited the CBD-enhancing effects on TMZ-, BCNU- or DOXO-induced cytotoxicity in U87MG cells, whereas over-expression of TRPV2 enhanced the CBD-mediated potentiation of chemotherapeutic drug-mediated cytotoxicity in MZC cells.

CBD has been found to promote apoptotic cell death and reduce growth of glioma xenografts, in vitro et in vivo, respectively ( 25 , 26) . However, because we use CBD at no cytotoxic and pro-apoptotic doses, it is presently unclear how CBD can enhance glioma cell chemosensitivity. Herein, we could suppose that CBD, by inducing TRPV2 channel activation, results in an increased drugs permeation into glioma cells.

In fact, despite great advances in the TRP channel field during the past decade, only a limited number of studies have reported the functional characterization of cation permeation and pore properties, or the description of TRP channel pore structures ( 8 , 39) . Permeation through TRP channels and other large pore cation channels, such as P2X7 adenosine triphosphate-gated channels, has been recently suggested as a new pharmacological tool to selectively introduce chemotherapeutic drugs into cancer cells with the intent/in order to increase their antiproliferative and cytotoxic effects ( 14 ).

Effective chemotherapy requires reasonably high levels of drug molecules accumulated into the cancer cells and long drug exposure times ( 40 ). Thus, by using the natural red fluorescent DOXO, we found that its uptake markedly increases only in TRPV2-over-expressing MZC TRPV2 glioma cells. Moreover, treatment of MZC TRPV2 cells with CBD, by activating TRPV2 channels, strongly promotes drug uptake as shown by enhanced fluorescence intensity and increased number of DOXO-positive cells. In addition, the CBD-mediated effects were completely inhibited by EGTA, suggesting a direct role of Ca 2+ in regulating CBD-induced TRPV2-mediated DOXO uptake and drug cytotoxicity.

The pore diameter of TRPV channels changes from 5.4 Å of TRPV6 to >6.8 Å of TRPV1 ( 9 , 39) , and channel activation by specific agonists may allow the flux of large monovalent cations ( 8 ). Thus, we hypothesized that activation of TRPV2 channel by CBD may cause a conformational change of the pore helix structure, favoring intracellular DOXO uptake, through the TRPV pore domain ( 9 , 39) . Thus, the idea that DOXO permeates directly through TRPV2 pore channel opened by CBD suggests a possible exploitation of the TRPV2 channel for the delivery of DOXO or other chemotherapeutic agents into glioma cells by the usage of TRPV2 agonists. In the same view, short-term experiments in N1E-115 neuroblastoma cells transfected with TRPV1 and exposed to CPS in combination with low concentrations of DOXO have indicated that this chemotherapeutic agent accumulates only in TRPV1-transfected cells. In addition, DOXO entry requires the exposure to CPS, suggesting that the drug permeates directly through the activated TRPV1 channels ( 14 ). Similar experiments have been also conducted in basal-like breast cancer cells that express TRPM8 using agonists for TRPM8 in combination with DOXO ( 14 ).

The pore region of TRP cation channels plays a crucial role for cation permeation and selectivity ( 39 ). It has been previously reported that transfection of TRPV2 channel in HEK293 cells increases Ca 2+ influx, and that (Ca 2+ ) je overload induces cell death ( 22 ). Moreover, mutations in the TRPV2 pore-forming domain reducing the extracellular Ca 2+ influx abrogates the TRPV2-induced cytotoxic effects without affecting TRPV2 channel trafficking on the membrane ( 22 ).

Our findings also provide evidence indicating that TRPV2 pore deletion abolishes CBD-induced Ca 2+ permeation, inhibits DOXO uptake, completely reverts the CBD-induced potentiation of TMZ, BCNU or DOXO cytotoxicity and increases the chemoresistance of glioma cells. Because TMZ (MW: 194) and BCNU (MW: 214) have molecular weight lower than DOXO (MW: 580), it is conceivable that TRPV2 channels can also mediate their uptake in glioma cells.

In conclusion, these data give strong biological evidences that could open the development of new effective pharmaceutical approaches for the treatment of GBM. The combination of CBD with alkylating agents, by increasing drug uptake and cytotoxic activity, allows to maintain high antineoplastic effects but at lower chemotherapeutic doses, thus reducing drug side effects.

Moreover, the ability of CBD to enhance drug-exerted cytotoxic activity might be not only restricted to glioma cells expressing high TRPV2 levels. Because TRPV2 is also expressed in low-grade gliomas ( 7 ), the properties of CBD, as its ability to increase TRPV2 expression and TRPV2-dependent alkylating drug effects, could be important in lower gliomas therapies too. In addition, it has been demonstrated that TRPV2 expression and/or activation was able to promote in vitro et in vivo GSCs differentiation and to inhibit their proliferation ( 17 ), suggesting that CBD could also be effective in reducing the proliferation of the GSC subpopulations present in GBMs ( 41 ). Because drugs selectivity for glioma cells is an important clinical issue, we also investigated the CBD and its chemotherapeutics effects in NHA cells. The results showed that NHA were refractory to CBD chemotherapeutics modulation, giving an additional interest in the use of CBD. Finally, the known CBD multiple pharmacological actions in the central nervous system and in the periphery (analgesic/anti-inflammatory, antioxidant anti-ischemic ( 24 )) and the absence of side effects on normal brain cells, strongly support CBD use in GBM therapies.

Supplementary material

Supplementary Figures 1 and 2 can be found at http://carcin.oxfordjournals.org/

Funding

Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) Regional Grant 2009–2011 (6353) and Fondazione Italiana Ricerca sul Cancro (FIRC) National Grant 2011–2013 (11095).

Conflict of Interest Statement: The authors declare no competing financial interests.

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    c1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosurea

  • CBD

  • cDNA

  • CPS

  • DOXO

  • EGTA

    ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid

  • GBM

  • MFI

    intensité de fluorescence moyenne

  • mRNA

  • MTT

    3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

  • NHA

  • RR

  • TMZ

  • 9 -THC

    ∆9-tetrahydrocannabinol

  • TRP

    transient receptor potential

  • TRPV2

    transient receptor potential vanilloid type 2.

© The Author 2012. Published by Oxford University Press. Tous les droits sont réservés. For Permissions, please email: journals.permissions@oup.com

Le cannabidiol déclenche le déclenchement du canal TRPV2 sensibilise les cellules du glioblastome aux agents chimiothérapeutiques cytotoxiques | Cancérogenèse – La meilleur Huile de CBD
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